水稻原位杂交测试服务服务为先武汉科锐诺生物

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菌落的裂解及DNA结合于纤维素滤膜

（1）在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2-3分钟。

（2）用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤（1）。

（3）吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜，再重复一次该步骤。

（4）吸干滤膜，把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜，转移到一张干的滤纸上，置于室温20-30分钟，使滤膜干燥。

（5）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80℃干烤2小时，固定DNA。

（6）将固定在膜上的DNA与32 P标记的RNA进行杂交。

目前，我国已稳定开展的分子病理技术主要有显色原位杂交、荧光原位杂交、PCR、荧光定量PCR、基因芯片和DNA测序技术。显色原位杂交(chromogenicinsituhybridization，CISH)技术是分子生物学、组织化学及细胞学相结合产生的一门新兴技术，是利用核酸分子单链间碱基互补的原理，将地1高辛或生物素标记的外源核酸探针与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成双链杂交分子，通过过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。根据探针种类不同可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交。

荧光原位杂交技（fish）原理：是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

荧光原位杂交技（fish）实验步骤：

1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min，风干，DEPC水浸泡。

5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。