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将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。

杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。

原位杂交法是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行定量定位的方法。原位杂交法可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。

原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

原位杂交第三天

1）用1ml含10％热灭清的MABT溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，后用1mlMABT溶液置换，25分钟。

2）用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。

3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。

4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色

5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。

6）4C冰箱保存。