将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。
原位杂交第三天
1） 用1ml含10％热灭清的MABT溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，后用1mlMABT溶液置换，25分钟。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。
4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色
5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
原位杂交技术在许多领域都有应用，以下是其中几个具体应用：
细胞生物学和发育生物学：在细胞生物学和发育生物学领域，原位杂交技术常被用于研究基因的表达和定位。例如，通过标记特定基因的探针，可以在细胞或组织中检测特定基因序列的存在和分布，进而了解基因在细胞分化、发育和功能中的作用。
基因组学和遗传学研究：原位杂交技术也可用于基因组学和遗传学研究。例如，通过标记多个基因探针，可以检测基因组中的多个基因序列，从而进行基因定位、基因表达谱分析、基因突变检测等研究。
病毒学和病原微生物研究：在病毒学和病原微生物学领域，原位杂交技术常被用于检测和定位病毒、细菌等病原微生物。例如，通过标记特异性或核酸探针，可以检测组织中病原微生物的存在、情况以及分布特征，从而为疾病的预防、诊断和提供依据。
总之，原位杂交技术在生物学、医学、基因组学、遗传学、病毒学和病原微生物学等领域都有广泛的应用价值，为人类认识生命现象、探究疾病机制和提供了有力的技术支持。
以上信息由专业从事荧光原位杂交的贝科新肽于2024/12/27 16:17:44发布
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