DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合,及在将其连接到载体上
这三个连续的步骤在连接酶的三个不同域进行,与双链DNA接触的各个域环绕DNA底物形成反应域。DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合,以及在分子克1隆前将其连接到载体上。
用于分子克1隆的DNA连接酶是细菌来源或者噬菌体编码。所有真细菌,无论是嗜热或嗜温,包含一个单一的连接酶基因,编码NAD*-依赖型的酶(Olivera and Lehman1967; Takahashi et al. 1984)。
在连接反应的第yi步中, 使用NAD的二磷酸作为磷酸1酐键和腺营基团转移到DNA连接酶赖氨酸残基的ε-氨基基团。腺苷酸残基然后转移到DNA底物的5-磷酰基末端,变得易于受到并列的3'羟基基团的亲核攻击。
这导致磷酸二酯键的形成,消去AMP,以及形成DNA链的共价连接。用于分子克1隆的DNA连接酶在连接非经典底物时能力有所不同,如平末端双链、DNA-RNA杂交体或单链DNA.这些以及其他的属性归纳于表5。分子克1隆中比较常用的催化体外连接的酶是T4噬菌体编码的DNA连接酶。
遗传控制中大的困难并不是DNA的,而是需要被的特异DNA段的分离 。如果以基因为目的,特异DNA段的分离将大大有助于获得与遗传信息同样多的相关的基因产物,一般说这些基因产物均为蛋白质多肽,因此抗该蛋白质的对于测定和沉淀蛋白质及其前体有重要用途,甚至可用于了解蛋白质分子量 。AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成的引物是与真核细胞mRNA分子3’端poly(A)结合的12~18个核苷酸长的oligo(dT)。置换合成法。该方法利用链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物。在大肠DNA聚合酶工的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点:①非常有效;②直接利用链反应产物,无须进一步处理和纯化;③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。以上信息由专业从事单核苷酸的友名生物于2021/10/15 7:21:42发布
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