原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎,在Holfretor水中培养,到达所需要的发育时期时,用蛋白酶去除卵膜,用4%多聚甲醛固定,在4℃保存,二十四小时后用50%甲6醇2%多聚甲醛溶液洗,然后换成甲9醇,在-20C 保存,待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧6水处理,去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养,可阻断色素的形成)
原位杂交(In Situ Hybridization)也叫原位杂交组化(in situ hybridization histochemistry, ISHH),是一种固相分子杂交的方法,bai它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织或细胞内特定核酸序列的方法。探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P,非同位素标记物中目前很常用的有生物素、地高6辛和荧光素三种。探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针和合成寡核苷酸探针。
原位杂交术可在原位检测细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达,有很高的敏感性和特异性,已成为细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。
根据不同的杂交实验要求,应选择不同的核酸探针。在大多数情况下,可以选择克0隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下,必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如,在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针,在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针(通过克0隆人M13噬菌体DNA获得)或RNA探针,寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强,适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体 ,但不适宜于组织原位杂交,因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下,寡核苷酸探针和短的PCR标记探针(80~150bp)具有较大的优越性。以上信息由专业从事原位杂交的思特进于2021/12/2 12:10:35发布
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