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原位杂交技术电话「多图」

来源:思特进 更新时间:2021-10-17 16:56:33

以下是原位杂交技术电话「多图」的详细介绍内容:

原位杂交技术电话「多图」 [思特进)1bfc755]"内容:原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测,与免6疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放9射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克6隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。

在条件都得到满足的情况下,杂交的成败就取决于保温时间。时间短了,杂交反应不完成;时间长了也无益,会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度(Co)和 反应时间(t)的乘积。实验表明Cot =100时,杂交反应基本完成。Cot=0,基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml(按单股DNA每微克 紫外吸收值为0.024计算,总的吸收值为 9.6),如果反应时间为21h,那么对于未标记的DNA来说,Cot =9.6/21 =100.8,,杂交完成了。对标记DN A(浓度为0.1μg/ml)来说Cot值为0.05,这就充分排除了标记DNA的自我复性。Tm值25℃时杂交zui佳,所以首先要根据公式(4)计算杂交体Tm 值。由此式可见,通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。

杂交技术zui重要的因素之一是选择zui适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10~15℃,碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链,错配对减少。若反应温度再低(Tm-30℃),虽然互补链之间也可形成稳定的双链,但互补碱基配对减少,错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA,调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍,因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验,即zui适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

zui适复性温度(Optimunm renaturation temperature, TOR):Tor =Tm –25℃

苛刻复性温度:Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻复性温度:Tns =Tm – (30或35℃)

以上信息由专业从事原位杂交技术的思特进于2021/10/17 16:56:33发布

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